Studier av immunfunktion hos patienter med mitokondriella sjukdomar

Studien är godkänd av Etikprövningsmyndigheten i Stockholm 2018-10-02, Diarienummer 2018/1498-31/3

Det mitokondriella nätverket finns i nästan alla celler i kroppen, och kallas ofta cellens kraftverk eftersom majoriteten av cellens energi kommer från mitokondrierna. Nedsatt mitokondriell funktion är kopplad till en grupp av ärftliga sjukdomar som kan drabba alla organ i kroppen, men ofta uppkommer symptom i hjärna, muskel eller lever. Det är inte ovanligt att patienter med mitokondriella sjukdomar drabbas extra hårt eller oftare av infektioner jämfört med den övriga befolkningen, trots detta finns mycket lite kunskap kring hur mitokondriella störningar påverkar immunsystemets funktion. Syftet med denna forskning är att studera och förstå hur mitokondriella brister påverkar immunsystemets funktion hos människor.

De specifika målen är:

1.  Att undersöka de kvantitativa skillnaderna mellan olika undergrupper av immunceller i perifert blod hos patienter med mitokondriella sjukdomar och friska kontroll individer

2. Att karakterisera aktiverings- och differentieringskapaciteten hos renade undergrupper av immunceller isolerade från patienter med mitokondriella sjukdomar.

3. Att analysera immunologiska fenotyper i musmodeller med mitokondriell dysfunktion, och följa upp fynd från våra humana studier.

Bakgrund
Mitokondrierna finns i nästan alla kroppens celler och de bildar ett dynamiskt nätverk som är helt nödvändigt för energiomsättningen i cellen. Denna energiomsättning sker via en process som kallas oxidativ fosforylering (OXPHOS) och utförs i elektrontransportkedjan (ETC). ETC är uppbyggd av fyra enzymkomplex (CI-IV) kopplade till komplex V som är ett ATP syntas. ATP är cellens energivaluta. Mitokondrierna utgör dock ett nav i ämnesomsättningen och ett flertal essentiella processer passerar eller utgår ifrån det mitokondriella nätverket som till exempel reglering av fria syreradikaler, kalciumhomeostas och programmerad celldöd eller så kallad apoptos.

Ärftliga mitokondriella sjukdomar är en undergrupp av medfödda ämnesomsättningsrubbningar med en förekomst på 1/5000, vilket gör dem till en av de vanligaste formerna av ärftliga ämnesomsättningssjukdomar [2].  Mitokondriella sjukdomar orsakas av mutationer antingen i mitokondriernas eget DNA (mtDNA) eller i gener i cellkärnans DNA (nDNA) som kodar för proteiner som importeras till mitokondrier. Dessa störningar kan resultera i symptom från nästan vilket eller vilka organ som helst, när som helst under en individs livslängd. 

Typiskt uppträder symptom ofta i det centrala och perifera nervsystemet, skelettmusklerna, hjärtmuskeln samt i lever-, njur- och retinala vävnader, vilka kännetecknas av höga energikrav. Kliniska symptom på mitokondriella störningar är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet, och inkluderar ofta neuropati, ataxi, mjölksyraförgiftning och strokeliknande episoder.

Även om det är allmänt accepterat bland kliniskt verksamma specialistläkare att patienter med mitokondriella sjukdomar har en ökad förekomst av infektionssjukdomar, har enbart ett begränsat antal studier publicerats som beskriver samband mellan mitokondriella störningar och immunsystemets funktion [3].

Under de senaste fem åren har forskning avseende mitokondriernas roll i immunsystemet genomgått en välbehövd renässans, vilket resulterat i utveckling av området immunometabolism. Det har nyligen påvisats att komplexa interaktioner mellan flera olika processer i ämnesomsättningen är väsentliga för aktivering och utmognad av immunsystemet (1). Att förstå dessa samband och undersöka den cellulära ämnesomsättningen kan därför vara till nytta när det gäller att utveckla metoder för att förbättra eller påverka immunsystemets funktion.

Syftet med denna studie är att ge en detaljerad beskrivning av immunologiska signaturer hos patienter som drabbats av mitokondriell dysfunktion.
Vi kommer att utnyttja vår kompetens inom mitokondriella sjukdomsmekanismer för att bättre förstå den viktiga roll som dessa organeller har för mänsklig immunitet.

Projektplan

Sammanfattningsvis kommer vi att studera blodprov från patienter med olika typer av mitokondriella sjukdomar. Dessa blodprov kommer att analyseras med avseende på att identifiera olika typer och undergrupper av immunceller samt deras individuella proportioner med mycket hög upplösning med hjälp av masscytometriska metoder samt RNA sekvensering

Vi kommer att använda: (i) flödescytometri för att mäta uppreglering av specifika markörer på cellytan och intracellulärt, samt utmognad av specifika immunceller; (ii) enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) för att kvantifiera mängd och utsöndring av specifika cytokiner; (iii) antikroppar märkta med utvalda tungmetallisotoper för att kvantifiera uttrycket av cirka 50 olika proteiner på en-cells-nivå och (iiii) analys av genuttryck med hjälp av Nanostring plattformen som möjliggör högkänslig genuttrycksprofilering av mer än 600 gener kopplade till immunfunktion.

Fynd från ovanstående analyser kommer att följas av funktionella studier i cell- samt musmodeller. Vi har tillgång till ett antal musmodeller med olika typer av specifika mitokondriella defekter, i vilka vi kan validera fynd från humanstudier samt utföra fördjupade och mekanistiska experiment avseende kopplingar mellan mitokondriella defekter samt immunsystemets funktion.

Det finns många olika typer av mitokondriella sjukdomar, med olika genetiska defekter och som dessutom uppvisar stora skillnader i klinisk bild. I en första studie har vi valt ut en specifik sjukdomsgrupp, Lebers ärftliga optikusneuropati (LHON), som kommer att studeras mer i detalj och som sedan kommer följas av andra grupper av mitokondriella sjukdomar. LHON är en förhållandevis homogen och relativt sett stor sjukdomsgrupp i Sverige. LHON kännetecknas av plötslig synnedsättning i tidig vuxen ålder, oftast mellan 15-35 år. LHON orsakas i 95% av fallen av en av tre mutationer i mtDNA, i gener som kodar för subenheter i komplex I i den mitokondriella andningskedjan, och den resulterande defekten kan mätas som en minskad aktivitet i komplex I i isolerade mitokondrier, t.ex. från en muskelbiopsi. I vissa fall av LHON utvecklar även patienterna andra symptom från centrala eller perifera nervsystemet eller ifrån muskelvävnad, och i vissa fall är man enbart en asymtomatisk bärare av mtDNA mutationen. Den varierande kliniska presentationen hos individer med LHON mutationer skulle kunna förklaras av att den genetiska orsaken är mer komplex, och är ett resultat av samverkan mellan mutationer i mtDNA och nDNA.

Metodik

Patientmaterial:
Perifert blod från patienter med mitokondriell sjukdom kommer att samlas in via Centrum för Medfödda Metabola Sjukdomar (CMMS) vid Karolinska Universitetssjukhuset. Prov från friska kontroller som är matchade för kön och ålder har redan samlats in via medverkanden Petter Brodin.

Som tidigare nämnts kommer vi initialt att studera patienter med LHON, och CMMS arbetar för närvarande med att upprätta ett register för både drabbade patienter och asymtomatiska mutationsbärare, vilket även underlättar rekrytering av tillräckligt många patienter för den aktuella studien. CMMS har även ett nära samarbete med patientorganisationen LHON Eye Society med många drabbade patienter och många bärare registrerade som medlemmar. Genom att rekrytera både drabbade och opåverkade mutationsbärare såväl som friska kontroller förväntar vi oss att upptäcka även små skillnader i immunfenotyper.

Masscytometrianalys av blodprover:

Vi kommer att använda masscytometri (CyTOF) för att analysera omkring 100 olika typer av vita blodceller i prov från mitokondriella patienter. Genom att använda antikroppar märkta med utvalda tungmetallisotoper kan CyTOF kvantifiera uttrycket av cirka 50 olika proteiner på en-cells-nivå, vilket möjliggör en djup och grundlig profilering av enskilda celler [6]. Med CyTOF kan vi detektera och kvantifiera olika typer och undergrupper av olika immunceller som till exempel T- och B-celler, makrofager, neutrofiler och dendritiska celler i våra patientprover. Applicering av masscytometri har fördelen att kunna detektera ett mycket större antal immunologiska markörer jämfört med flödescytometri, vilket ger mycket högre upplösning av immunsystemets sammansättning.
Efter immuncellsanalyserna, kan funktionella studier på renade undergrupper isolerade med FACS utföras. Detta kommer att innefatta in vitro-analyser av immuncellaktivering, proliferation, differentiering och apoptos från patientceller.

Provtagning:

Blodprover (20 ml är tillräckliga för: CyTOF-fenotypning, funktionell testning, helblod mRNAseq och plasma) från patienter i CMMS-kohorten (med genetiskt och/eller metabolt karakteriserad mitokondriell dysfunktion) och friska kontroller samlas in med intervall (minst två gånger).


Arbetsplan:
Perifert blod från patienter med mitokondriell sjukdom kommer att kryopreserveras och analyseras därefter samtidigt för att minska variation mellan mättillfällena. Vidare kommer insamlingen av longitudinella prover från samma individer att tillåta oss att bestämma reproducerbarheten av våra fynd.

 
Sammanfattningsvis kommer detta att bli den första omfattande analysen av immunologiska signaturer hos patienter med mitokondriella störningar. Denna studie kommer att ge en viktig inblick i och förståelse för hur mitokondriell dysfunktion påverkar immunsystemet, detta kommer bidra till en ökad förståelse avseende sjukdomsmekanismer och möjliggöra för utveckling av nya behandlingsmetoder för patienter med mitokondriella störningar. 

Referenser

  1. Mehta M. et al. Nature Reviews Immunology 17, 608-20 (2017)
  2. Gorman G. et al. Ann Neurol May; 77(5), 753–759 (2015)
  3. Garone C. et al. Brain Nov 3326-32 (2011)
  4. Gessner BD. et al. Journal of Pediatrics 163, 1716-21 (2013)
  5. Reichenbach JR. et al. Pediatric Research 60, 321-26 (2006)
  6. Benadall S. et al. Science May, 332(6030): 687–696 (2011)